多铜氧化酶在大肠杆菌中的分泌表达

生物胺是存在于发酵食品中的一类有机物，过量摄入会危害人体健康。多铜氧化酶中的某些酶具有降解多种生物胺的活性，在减控发酵食品中的氨(胺)类危害物方面具有良好的应用前景。研究多铜氧化酶的分泌表达，对酶的特性改造和工业化生产与应用具有重要意义。本研究通过在解淀粉芽孢杆菌来源的多铜氧化酶N端融合信号肽PhoA实现了多铜氧化酶在大肠杆菌中的分泌表达，胞外酶活为69.8 U/L。通过优化诱导条件和酶的分泌确定了多铜氧化酶最优发酵条件为诱导温度25℃、IPTG浓度0.05 mmol/L、诱导时菌体OD600=1.0、诱导6 h后添加150 mmol/L甘氨酸；发酵40 h时胞外多铜氧化酶酶活达到238.1 U/L，是优化前的3.4倍。     

重组大肠杆菌表达17β-羟基类固醇脱氢酶全细胞催化合成宝丹酮的研究

宝丹酮作为一种重要的蛋白同化雄性激素类固醇，具有提升肌肉质量和耐力的功能。宝丹酮的传统合成方法是以1,4-雄烯二酮（ADD）为底物通过化学法合成，但过程复杂、污染严重。17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）可催化甾体化合物C-17位点的氧化还原反应，实现ADD和宝丹酮的相互转化。本研究通过基因序列同源性分析，筛选到6种不同来源的17β-HSD基因并对其在大肠杆菌中进行异源表达。利用不同重组菌转化ADD合成宝丹酮，结果表明重组菌BL21/pET28a-HSDPy的ADD转化率最高，因此选择BL21/pET28a-HSDPy进行进一步研究。鉴定了重组菌的酶学性质并优化其全细胞转化条件。结果表明在生物量为36 g·L^-1、底物浓度为5.40 g·L^-1条件下，经过两次补料，获得了3.66 g·L^-1宝丹酮，比优化前提高了4.1倍。而且在生物转化过程中未检测到副产物。为生物合成宝丹酮提供了可能。     

甘油预处理蔗渣的木质素分离提取及结构表征

以甘油分别对甘蔗渣进行常压甘油自催化（AGO）预处理和常压甘油碱催化（al-AGO）预处理。利用酸沉法分别从预处理液中得到自催化甘油木质素（AGOL）和碱催化甘油木质素（al-AGOL）。利用单因素实验和正交实验得到最佳木质素提取工艺为转速8000r/min、离心时间15min、甘油混合液pH为3、甘油混合液浓度10%，在该条件下木质素AGOL和al-AGOL提取率分别达到72%和76%。采用扫描电镜（SEM）、元素分析、紫外光谱（UV）、凝胶色谱（GPC）、核磁共振¹H谱、热重分析以及抗氧化活性分析等技术手段对提取得到的木质素进行结构表征。结果表明：从甘蔗渣中提取的球磨甘蔗木质素（MBL）、AGOL和al-AGOL主要呈现出球形特征；AGOL和al-AGOL具有相似的活性特点，与MBL相比，AGOL和al-AGOL的分子量更小、分布更窄、均一性更好，热稳定性和抗氧化活性更高，有望成为重要的工业原料。     

谷氨酸结晶中的细晶回用工艺

谷氨酸工业结晶过程中会产生大量难以分离回收的细晶,影响收率和产品质量。文中提出了结晶-粒径切割沉降-细晶回用的工艺设想,将不同粒径的晶体分步分离,细晶浓缩后作为晶种回用至结晶过程。使用扫描电镜和粉末X-衍射(PXRD)研究细晶的晶习及其作为晶种回用的可行性,进行不同条件下的分批等电结晶,参考结晶速率、聚结度、CSD等参数确定细晶回用量、适用过饱和度范围等回用条件。结果表明:液体细晶表观为非典型四方六面体,但在谷氨酸结晶中晶面具有自我修复能力;过饱和度和细晶回用量均影响结晶过程,液体细晶的最适过饱和度范围为1-3;在过饱和度S=2时液体细晶的最适回用量(质量分数)为1%,在S=3时最适回用量为3%。最终证明通过控制合适的晶体生长环境,细晶回用的谷氨酸结晶工艺是可行的。     

重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇合成途径的平衡优化

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butantriol,BT）属于非天然化学品,是军工材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯的前体。在重组大肠杆菌中,木糖经脱氢、脱水、脱羧和还原合成BT。但途径各反应不平衡使得中间代谢物积累限制菌体生长和产物合成。本研究首先通过CRISPR/Cas9敲除基因yjhG和yqhD构建无本底表达宿主菌,随后利用不同启动子组合调节BT合成途径中基因xdh、yjhG和yqhD的表达。结果发现,以P _inv 表达醇脱氢酶基因yqhD使BT产量达到14.4g/L;以P _tac 表达脱氢酶基因xdh和P _{rrnH P1}表达脱水酶基因yjhG的组合方式,BT产量达到15.6g/L,比对照菌株KXW3009分别增加5.9%和14.7%。本研究通过对中间代谢物木糖酸合成和代谢的组合优化,促进了BT的合成,为后续研究提供了借鉴。     

不同基酒处理对杨梅利口酒品质的影响

以杨梅果汁为主要原料,将不同基酒(食用酒精、清香型白酒、杨梅蒸馏酒)与其混合调配,分别采用全二维气相色谱飞行时间质谱联用及超高效液相色谱对其挥发性成分和单体酚进行分析。结果表明,杨梅蒸馏酒与食用酒精处理利口酒中单体酚的种类与含量均没有显著差异,清香白酒处理利口酒中单体酚含量则显著低于上述2种利口酒;此外,杨梅蒸馏酒处理得到的利口酒中香气化合物的检出数量与相对含量均要高于其他2种处理;偏好分析结果表明,青年学生群体最喜欢杨梅蒸馏酒和杨梅果汁调配的利口酒。该研究明确了不同基酒处理对杨梅利口酒品质的影响,为杨梅利口酒酿造工艺的进一步开发及优化提供基础数据与理论依据。     

瓶装黄酒蛋白组成分析及其主要成分的分离纯化

为了研究瓶装黄酒中的蛋白组成,并纯化其主要成分;采用双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)及基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析瓶装黄酒的蛋白组成,并纯化α-淀粉酶抑制剂0. 19;瓶装绍兴黄酒中蛋白主要包括来源于小麦的α-淀粉酶抑制剂0. 19、类燕麦蛋白和病程相关蛋白,以及来源于大米种子的过敏蛋白RAG2和α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂RA16,纯化后的α-淀粉酶抑制剂0. 19经SDS-PAGE检测,得到一条分子质量大小为13. 7 k Da的蛋白条带;瓶装黄酒中只含有小麦和大米蛋白,且α-淀粉酶抑制剂0. 19的蛋白点数量最多,是瓶装绍兴黄酒蛋白的主要成分,研究蛋白的结构特点及其对黄酒浑浊形成的影响可为解决浑浊问题提供理论依据。     

江苏单二啤酒大麦麦芽麦汁中混浊物质的研究

对江苏单二啤酒大麦麦芽麦汁中混浊物质成分进行了研究,结果表明多糖是麦汁混浊的主要成分,含量为82.57%,其次为蛋白质和多酚。采用离子交换色谱技术对混浊物质中的糖类进行了研究,结果表明糖类物质的单糖组成以葡萄糖为主,其次为半乳糖、阿拉伯糖、木糖。采用SDS-PAGE电泳结合基质辅助激光解析飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF)对麦汁混浊物质中蛋白质组分进行了鉴定,结果表明蛋白质分子量主要分布于25~45ku及小于18.4ku的两个部分,且主要来自于麦芽水溶蛋白及醇溶蛋白,质谱分析表明混浊蛋白主要为AMY2/BASI复合体A链,此外还有少量的Z4蛋白、大麦醇溶蛋白γ3、油体钙蛋白2及BTI-CMe2.1。本研究结果对于改良江苏啤酒大麦及其麦芽品质具有指导借鉴意义。     

budR表达水平对克雷伯氏菌甘油代谢的影响

通过过量表达和反义RNA抑制改变budR表达水平,考察budR表达水平对克雷伯氏菌甘油代谢的影响。过表达budR使得Bud B和Bud C的酶活提高了48.7%和69.7%,1,3-丙二醇产量降低了12.6%,2,3-丁二醇含量增加了73.3%,同时乙酸含量显著降低。反义RNA抑制budR表达后,Bud B和Bud C酶活分别降低了56%和78%,重组菌的生物量、2,3-丁二醇(BDO)、乙酸、乳酸等均表现为略有降低,1,3-丙二醇含量达到23.4g/L,提高约10%。上述结果进一步丰富了budR基因在调控bud操纵子的表达水平、2,3-丁二醇合成及克雷伯氏菌甘油代谢中的作用,为后续代谢改造克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇提供了新的思路。     

子宫内膜腺癌中MMP-2、MMP-9表达的免疫组化研究

目的:探讨基质金属蛋白酶-2、-9(Matrix metalloproteinases,MMP)在子宫内膜腺癌组织中的表达及其与临床病理关系。方法:应用免疫组化SP法检测MMP-2、MMP-9在不同子宫内膜组织中的表达情况。结果:MMP-2在正常子宫内膜、子宫内膜增生症和子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率分别为15.0%、26.7%、88.0%,MMP-9的阳性表达率分别为25.0%、33.3%、95.0%,MMP-2和MMP-9的表达在子宫内膜腺癌中均明显高于正常子宫内膜、子宫内膜增生症,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。MMP-2、MMP-9的表达强度与子宫内膜腺癌的手术-病理分期、组织学分级、肌层浸润和淋巴结转移相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:MMP-2、MMP-9在子宫内膜腺癌的发生、发展过程中起促进作用,且两者表达与子宫内膜腺癌的浸润深度和转移程度有关,为早期诊断子宫内膜腺癌以及子宫内膜腺癌的预后判断、靶向治疗提供了可靠的依据。